Endotoxinnachweis mittels LAL- und rFC-Test bei Eurofins BioPharma Product Testing DACH
Der Endotoxinnachweis mittels LAL-Test oder rFC-Test überprüft die Sicherheit, nämlich Abwesenheit von Endotoxinen, steriler pharmazeutischer Produkte für den menschlichen Gebrauch. Darüber hinaus spielt der Nachweis von Endotoxinen in nicht-sterilen Produkten, als auch bei der Analyse von pharmazeutischem Wasser eine wichtige Rolle.
Der Nachweis bakterieller Endotoxine, welche von gramnegativen Bakterien stammen, erfolgt nach wir vor hauptsächlich unter Verwendung von Amöbozytenlysat (LAL), welches aus Pfeilschwanzkrebsblut gewonnen wird (Limulus polyphemus oder Tachypleus tridentatus). Die enstprechenden Kapitel wurden zwischen dem Europäischen Arzneibuch ((EP) 2.6.14.), dem Arzneibuch der Vereinigten Staaten ((USP) <85>) und dem Japanischen Arzneibuch ((JP) 4.01) harmonisiert. Endotoxine sind für Mensch und/oder Tier giftig und verursachen eine pyrogene Reaktion (Anstieg der Körpertemperatur). Aus diesem Grund ist es wichtig, dass Medikamente und Medizinprodukte, die entweder injiziert oder implantiert werden, auf ihren Pyrogen- un damit Endotoxingehalt getestet werden.
Der Nachweis von Endotoxinen wird auch für die Bewertung von Medizinprodukten wie Einweggeräte und Implantate verwendet. Dazu wird das Testprodukt mit pyrogenfreiem Wasser (PFW) extrahiert und auf das Vorhandensein von Endotoxin in den Extrakten getestet.
Für die Durchführung des Endotoxintests stehen mehrere Methoden zur Verfügung, darunter der in-vivo Pyrogentest (Kanninchentest, Rabbit Pyrogen Testing, RPT) und die in-vitro Limulus-Amöbozyten-Lysat-Test, kurz LAL-Test und der rekomibinate Faktor C-Test, kurz rFC-Test. Zur Durchführung des LAL-Tests stehen verschiedene Methoden zur Verfügung, wie das Gel-Clot-Verfahren, das kinetisch-turbidimetrischen (KTA) Verfahren und das kinetisch-chromogenen (KCA) Verfahren. Der Nachweis von Pyrogenen, die nicht Endotoxine sind, soll nach der europäischen Kommission (Ph. Eur.) nicht mehr über den Kaninchenpyrogentest erfolgen, sondern bis 2026 vollständig durch den Monocyte Activation Test (MAT) ersetzt werden.
Die Eurofins BioPharma Product Testing DACH unterstützt Sie ebenfalls gerne, wenn Sie einen Bedarf an MAT-Testungen haben.
TESTPRINZIP des LAL-Tests:
LAL Kinetisches chromogenes (KCA) Verfahren und kinetisches turbidimetrisches (KTA) Verfahren
Eurofins BioPharma Product Testing DACH bietet die Durchführung sowohl kinetisch-chromogener Assays, als auch kinetisch-turbidimetrischer Assays an. Bei der chromogenen Methode handelt es sich um eine enzymatische Reaktion zwischen Endotoxin und dem modifizierten LAL-Lysat, die zur Erzeugung einer gelben Farbe in Gegenwart von Endotoxin führt. Die Intensität der Farbproduktion steht in direktem Zusammenhang mit der in der Probe vorhandenen Endotoxinmenge. Daher können wir mit Hilfe von Endotoxin-Standards den Wert des im oder auf dem Produkt vorhandenen Endotoxins berechnen. Einige Produkte haben eine Eigenfarbe, die Messung mittels KCA-Test stören würde, so dass die turbidimetrische Methode verwendet werden kann. In diesem Fall wird KTA-Lysat verwendet und die Reaktion mit Endotoxin führt dazu, dass die Lösung trüb wird und somit die Quantifizierung des Endotoxingehalts farbunabhängig möglich ist. Beide Methoden verwenden objektive Messungen zur Bestimmung des Endotoxingehalts und sind quantitativer Natur und daher dem Gel-Clot vorzuziehen.
LAL Gel-Clot Assay
Der Gelgerinnungstest (Gel-Clot Assay) war die ursprüngliche LAL-Methode. Es handelt sich um einen qualitativen oder semi-quantitativen Test, der zum Screening auf das Vorhandensein von Endotoxinen verwendet wird. Die Bildung eines festen Gels zeigt das Vorhandensein von Endotoxinen in der getesteten Probe an.
PROBENANFORDERUNGEN für den LAL-Test:
Produktvalidierung, Test auf Hemmung und Verstärkung
PROBENANFORDERUNGEN [FDA- und AAMI-Richtlinien]:
Proben aus drei (3) Produktionschargen sollten auf Hemmung und Verstärkung getestet werden, bevor dieser Test als für die Verwendung mit dem Testprodukt validiert gilt. Die Anzahl der für jede Charge benötigten Proben ist die gleiche wie * unten.
HINWEIS: Validierungstests können zur gleichen Zeit und an den gleichen Proben wie die Chargenfreigabe (Fertigprodukttest) durchgeführt werden.
Endotoxintestung von Wasserproben oder anderen Flüssigkeiten.
PROBENANFORDERUNGEN:
1 mL Probe in einem verschlossenen endotoxinfreien Polystyrol oder Glasbehälter.
Quantitative Bestimmung des Endotoxingehalts für feste Materialien / Medizinprodukte
*PROBENANFORDERUNGEN [FDA-Richtlinien]:
Für Chargen von weniger als 30 Einheiten - 2 Stück
Für Chargen mit 30-100 Einheiten - 3 Stück
Für Chargen von 101 Einheiten oder mehr - 3% der Chargengröße in Stücken
TESTPRINZIP des rFC-Tests, eine Alternative zum LAL-Test
Die EDQM hat das Europäische Arzneibuch (EP) Version 10.3 veröffentlicht, das nun das neue Kapitel 2.6.32 "Test for bacterial endotoxins using recombinant factor C (rFC)" enthält. Der Faktor-C-Assay ist daher eine tierfreie und gute Alternative zum Nachweis von Endotoxinen in Europa. Die USP arbeitet ebenfalls an einem Kapitelentwurf (USP <1085.1>) zur Verwendung des rekombinanten Faktors C.
Das rFC-Enzym, das aus der Pfeilschwanzkrabbe kloniert wurde, wird rekombinat hergestellt und wenn Endotoxin an den rekombinanten Faktor C bindet, spaltet das aktivierte rFC-Enzym ein synthetisches fluorogenes Substrat ab, wodurch die Lösung fluoresziert. Wir bieten unterschiedliche rFC-Testkits an und sind unabhängig von den Herstellern.
Die Eurofins BioPharma Product Testing DACH ist in der Lage, Sie mit gut aufgesetzten Vergleichsstudien zu unterstützen, um den möglichen Wechsel der Methode - von LAL zu rFC zum Nachweis von Endotoxinen in Ihren Produkten - zu ermöglichen.
